Elle grandit à Oklahoma City en Oklahoma. Son père, Carter Mullally jr était un acteur chez Paramount Pictures durant les années 1950 et sa mère était un mannequin professionnel. Megan étudie le ballet dès l'âge de six ans et danse dans des spectacles durant l'école secondaire.
Mullally a révélé durant un épisode du Tonight Show en mars 2006 que sa mère la laissait habituellement seule durant presque toute la journée pendant qu'elle travaillait. Elle a raconté la journée durant laquelle une amie et elle ont téléphoné à des étrangers trouvés dans les annonces classées d'un journal pornographique. Les deux jeunes filles sont alors allées voir un film pornographique français et en ont profité pour flirter avec les membres d'une convention de facteurs qui se tenait dans un hôtel où ils séjournaient.
Après avoir été diplômée de la Casady High School, elle fréquente l'université Northwestern où elle étudie la littérature anglaise et l'histoire de l'art. Elle fait du théâtre localement et en vient à quitter l'université sans diplôme. Elle fait du théâtre à Chicago pendant six ans.
Mullally déménage à Los Angeles en 1981 et signe avec l'agence William Morris après seulement deux semaines. Elle commence alors à jouer de petits rôles au cinéma. Son premier rôle à la télévision a lieu dans la série The Ellen Burstyn Show (1986). Elle apparaît dans des sitcoms populaires comme Seinfeld, Frasier, Wings et Dingue de toi.
Mullally joue pour la première fois à Broadway en 1994 dans la pièce Grease et plus tard dans How to Succeed in Business Without Really Trying. Elle donne son propre one-woman show, intitulé Sweetheart, à Los Angeles en 1999.
En 1998, elle obtient le rôle de Karen Walker, l'assistante de Grace dans la comédie Will & Grace sur le réseau NBC. Elle remporte deux Emmy Award en 2000 et 2006 de la meilleure actrice pour un second rôle dans une série comique. Elle est finaliste à ce titre aussi de 2001 à 2005.
De plus, elle a gagné trois prix de la Screen Actors Guild. Lors de la cérémonie des Emmy Awards de 2005, elle a chanté le thème des Arpents verts, en jouant son personnage de Karen Walker, en compagnie de Donald Trump.
Mullally est aussi une chanteuse et a créé son propre groupe, nommé The Supreme Music Program. Ce dernier a fait deux albums bien reçus par la critique : The Sweet-Heart Break et Big as a Berry.
Mullally s'est ouvertement déclarée bisexuelle dans une entrevue en 1999 avec le magazine The Advocate.
Elle s'est mariée avec l'acteur Nick Offerman, qui a joué dans Will & Grace durant sa quatrième saison, en septembre 2003. Elle avait déjà été mariée à l'agent Michael Katcher au milieu des années 1990.
Comme la huitième saison de Will & Grace a été la dernière, Mullally compte animer un talk show à partir de l'automne 2006.
Elle a fait des publicités pour les bonbons M&M et pour le site Web cheaptickets.com.
